كبديل، يُمكن تفضيل سجلات C57BL/6 الممتازة، نظرًا لقلة استخدامها في أنظمة ترشيح الجينات الداخلية، ولأن معظم أجهزة بناء CRISPR تعتمد على C57BL/6 كجينوم مرجعي. يُمكن الحصول على معظم بيانات التسلسل الجينومي لبناء الحمض النووي للمتبرع بفضل اتحاد تسلسل جينوم الفأر الجديد (MGSC). يجب فحص موضع كل إدخال مُستهدف بعناية لتجنب تأثيره على وظائف تنظيم الجينات. على الرغم من استخدام CRISPR، يصعب إنتاج إدخالات أكبر من 5 كيلو بايت في الفئران.

لإنتاج أليل ناقض مشروط جيد، يُؤدي استخدام حمض نووي SS طويل واحد من مانح ذي إكسون/إكسونات مُفلَكة ممتازة أداءً أفضل من مجرد استخدام اثنين من sgRNAs لإدخال مواقع loxP في وقت واحد. ولكن بخلاف الظروف الفعلية للزيجوت الفأري، سيتم التحقق من صحة sgRNAs داخل الخلايا إذا كانت الفئران المانحة لأبحاث الكيسة الأريمية متاحة بشكل شائع (ران وآخرون، 2013أ). على سبيل المثال، يمكن استخدام أنسجة Es (وانغ وآخرون، 2013؛ يانغ وآخرون، 2013) لتحديد أداء تعديل الجينوم قبل الحقن، لأن أنسجة Parece تُقدم أعلى كفاءة HDR مقارنةً بالأنسجة الجسدية (يو وآخرون، 2015).

عوامل اليوم

بالإضافة إلى كفاءة sgRNA، هناك قلق آخر يتعلق بتعديل الجينوم، وهو احتمال حدوث طفرات خارج النطاق، خاصةً عند محاولة التعرف على نمط ظاهري جيد للفأر. يوفر برنامج CRIPSR لبنية sgRNA قائمة بالمواقع المحتملة خارج النطاق دفع كازينو western union المستهدف، لذلك، عند الإمكان، يُجرى نهج قائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتحديد طفرات الحذف والإدراج في هذه المواقع باستخدام اختبار عدم التطابق الكيميائي. سيُجرى التهجين مع فأر بري "نظيف" لعزل أي طفرات غير مرغوب فيها (وإن أمكن، سيتم إجراء تهجينين على الأقل لتقليل الطفرات خارج النطاق المستهدف) (Raveux et al., 2017).

الخطوة 2 قم بالإعداد ويمكنك إنشاء ركيزة خطية بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل

قد يكون تعديل معاييرنا لنطاق الإباضة الفائقة والزيجوت ضروريًا، مع ذلك، عند استخدام ضغوط إضافية (Qin et al., 2016). يمكن إنتاج sgRNA وmRNA Cas9 للزيجوت الفأري إما عن طريق الحقن السيتوبلازمي، باستخدام مُعالج دقيق قائم على البيزو، أو عن طريق الحقن النووي، باستخدام مُحقن دقيق (Yang et al., 2014). بشكل عام، لم يُلاحظ أي اختلافات ظاهرية في بعض أنواع التسليم (Horii et al., 2014).

لتحرير الجينوم داخل الخلايا الثديية، من المرجح أن يؤدي هذا النوع من عمليات الحذف إلى تعطيل جين ما بسبب طفرة إزاحة الإطار. ومع ذلك، في حال توفر الحمض النووي للمتبرع، يُعالج DSB الجديد باستخدام HDR، سواءً بتردد أقل من NHEJ. تم تعديل CRISPR-Cas9 لاحقًا للتلاعب الوراثي في الحيوانات الكاملة، مثل إنتاج طفرات أو تعديلات على الفئران.

يمكن استخدام إعادة التركيب أيضًا لإجراء عمليات الحذف، والطفرات الجزئية، والتضاعف، والانعكاسات، والاندماجات، والعلامات. ركيزة خطية من الحمض النووي تحتوي على التغيير المطلوب أو المتماثلات، تُدخل إلى الحمض النووي المستهدف للعضلة. Gam ليس ضروريًا لإعادة التركيب، ولكنه يزيد من حجم إعادة تركيب الحمض النووي ثنائي السلسلة إلى 20-فليكس. Exo هو إنزيم خارجي خاص بالحمض النووي ثنائي السلسلة بطول 5'→3'، وهو ضروري لإعادة تركيب الحمض النووي ثنائي السلسلة. بروتين بيتا الأساسي الجديد، وهو بروتين تلدين ممتاز للحمض النووي أحادي السلسلة، هو إنزيم إعادة التركيب المركزي في عملية إعادة التركيب. والأهم من ذلك، أن خصائص إعادة التركيب الأساسية، مثل بروتين إعادة التركيب الرئيسي RecA، مطلوبة عادةً لإعادة التركيب.

وفقًا للخطة المنشورة على موقع loxP الإلكتروني، تُؤدي عملية إعادة التركيب الجيني الجديدة إلى إزالة أو عكس الجينات المستهدفة. ونظرًا لطبيعة cre-loxP القابلة للتحريض، فإن الجين الجديد سيُسببه سموم مثل التتراسيكلين والتاموكسيفان. يُنشّط التتراسيكلين عملية نسخ إنزيم إعادة التركيب الجيني الجديد، بينما يتولى التاموكسيفان مسؤولية النقل النووي. تهدف البادئات الجانبية إلى توليد عنصر في المكان الذي يقع فيه الحذف غير المتماثل في جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل الجديد. يُقسّم إنزيم T7E1 (WT – النمط البري؛ HT – متغاير الزيجوت) الجينات غير المتطابقة لإنتاج قطعتين أصغر في مصل أجاروز نشط.

بينما يُحرك أوليفاريس صدورهم لخوض معركة جديدة على يمين كاستيلو، تُشكّل لكمة كاستيلو العلوية اليمنى إطارًا على شكل حرف A لمنع أوليفاريس من الحصول على ضربة الخطاف السفلي. بالنسبة لنوع الجسم المُستخدم، يُوجّه كاستيلو لكمة علوية لإفساح المجال أمامه لخوض المعركة، مُعيدًا الكرة إلى مسافة بعيدة. ولكن عندما لا يكون أوليفاريس قادرًا على خوض المعركة على جبهتهم المُعتادة، تنخفض قدرته على التلاعب بضرباته المتبقية بشكل كبير.

إلى جانب أعلى حالات الحذف، فقد ثبت أن أعلى معدلات الإدخال الجينومي ممكنة باستخدام تقنية كريسبر (تشانغ وآخرون، 2015). يُنصح بتجنب استخدام sgRNAs المزدوجة كوسيلة لزيادة احتمالية استهداف الجين الجديد، خاصةً إذا كان تعديل الجينات ثنائي الأليلات مطلوبًا (تشو وآخرون، 2014). وُصفت الطفرات غير المستهدفة غالبًا بأنها تُعدل جينوم كريسبر في خلايا سرطان الفرد، ولكنها قد تكون نادرة في الزيجوت لدى الفأر (فو وآخرون، 2013؛ يانغ وآخرون، 2013). ومع ذلك، لا تزال الطفرات غير المستهدفة تُمثل مشكلة عند دراسة الفئران المُعدّلة وراثيًا. يؤدي قطع واحد من Cas9n إلى كسر في الوتر يُمكن إصلاحه بسهولة؛ ولإنشاء DSB أصلي، يلزم وجود عدد قليل من sgRNAs. تتميز تقنية CRISPR-Cas9 بقدرتها على تغيير الجينات بشكل كبير داخل أنسجة الخلايا الجذعية المكونة للدم باعتبارها وسيلة لتعديل الجينوم داخل الفئران، بما في ذلك سهولة الإطار والوقت الأسرع اللازم لإنتاج الفئران المخترعة.

• لأن مدينة دوران تضع رأسها على الجانب الشرفي العلوي من بالومينو، لا يستطيع بالومينو رمي الخطاف الأيمن على الرأس.
• تفتقر صفحات EcoRI المهتمة إلى تثبيت الحمض النووي للمتبرع للسماح بتحديد النمط الجيني للفأر الذي تم إنشاؤه بواسطة CRISPR حيث لم يتم قطع شريط KI PCR بواسطة Re أيضًا.
• ومع ذلك، قد تحتاج عمليات الإدراج أو الحذف الأعلى إلى بضعة sgRNAs لتمتد بالكامل على طول الحمض النووي الجينومي ليتم تغييرها أو التخلص منها.
• يتم تفضيل عادات الفئران الشرطية لفحص الموقف الفردي حيث يظهر كل منها تشابهًا في النمط الظاهري عندما يتم محو جينات معينة.
• تم عمل إدخالات بحجم 1-2 كيلوبايت فقط باستخدام تقنية CRISPR، ولكن نتائج HDR تتضاءل بشكل أساسي مع توسع حجم المنشور الجديد إلى ما يتجاوز طوله.

بالإضافة إلى قدرة إنزيم نوكلياز الحمض النووي على Cas9، أُعيد تصميم CRISPR ليشمل وظيفةً موجهةً للحمض النووي الريبوزي (RNA) للتحكم في النشاط النسخي الجديد للجينات الموجهة. يتحقق ذلك من خلال استخدام Cas9 مُعطّل (dCas9) مرتبط بمنشطات النسخ، ومثبطات النسخ، ومعدلات التخلق الجيني (Komor et al. 2017). كبديل، يمكن أيضًا تفعيل الجينات المستهدفة التي تحتوي على Cas9 باستخدام sgRNAs ميتة معدلة مبنية على أبتامرات MS2 دبوسية الشكل. يتم اختصار هذه sgRNAs الميتة لمنع تطور DSB، حيث تُسجل أبتامرات MS2 بروتينات اندماجية مكونة من بروتين نهاية بكتيريا MS2 الجديد المرتبط بمنشط نسخي (Liao et al. 2017). وقد ثبت أن أسلوب تنشيط الجينات فعال في الفئران من أجل توجيه التعبير الموجه من الجينات المعترف بها للمساعدة في تحسين الأمراض بما في ذلك جميع أشكال مرض السكري، ومشاكل الكلى، وضمور العضلات.

أدى تركيز هذا الجين على العملية، والتطور اللاحق لتقنية CRISPR-Cas9، إلى تقليص وقت تطوير الفئران المعدلة وراثيًا من 8 إلى 10 أسابيع إلى 3 أشهر. ومع ذلك، فقد حلت تقنية CRISPR-Cas9 محل ZFNs وTALENs من حيث البنية والهيكل البسيطين (الشكل 1). يجب أن يكون لدى ZFNs وTALENs نطاقات ربط متعددة الأجزاء للحمض النووي لكل هدف جينومي جديد. تعتمد تقنية CRISPR على تكوين أحدث بروتين نووي ريبوزي بين نوكلياز الحمض النووي Cas9 وRNA "الدليلي" لتحديد مكان حدوث DSB الجينومي عند حوالي 20 bp من تنسيق الخلافة التابعة.